Реал-тайм ПЛР для виявлення РНК коронавірусу “SARS-CoV-2 три гени” та ендогенного внутрішнього контролю (РНКаза Р)
Виявлення коронавірусу SARS-CoV-2 методом ПЛР за трьома генами з ендогенним внутрішнім контролем - 96 реакцій
Код продукту: PD2
Дізнатись ціну

Тест PolyDiagnostics “SARS-CoV-2 три гени” розроблений для виявлення коронавірусу методом ПЛР в реальному часі за трьома цільовими генами: E-ген (FAM), N-ген (HEX), та RdRp (ROX). Використання трьох генів в наборі дозволяє максимально точно виявляти  наявність або відсутність збудника гострої респіраторної хвороби COVID-19.

Для простоти використання оператором в наборі застосовується ендогенний внутрішній контроль – РНКаза Р. Він дозволяє проводити ефективний моніторинг забору матеріалу та перебігу реакції ПЛР, що є першочерговим для отримання достовірного результату аналізу.

Набір має 100% специфічність, тобто не дає жодної кросс-детекції з іншими організмами.

Кожен набір комплектується розхідним матеріалом для ПЛР реакції — 96-и луночними планшетами та плівками для них. Для максимальної сумісності з ПЛР приборами фірма пропонує два варіанти набору: з високопрофільним пластиком (наприклад, для Bio-Rad IQ5, Applied Biosystems 7500) та низькопрофільним пластиком (наприклад, для Bio-Rad CFX).

Враховуючи потреби та побажання наших  клієнтів ми розробили цей тест для швидкого та надійного визначення всіх відомих штамів SARS-CoV-2, включаючи новий Британський штам VUI-202012/01.

Набір “SARS-CoV-2 три гени”  розроблено для  вашої простоти, оскільки для проведення дослідження необхідно змішати реагенти всього один раз – зворотня транскрипція та ПЛР проходять в  одній пробірці. Одна реакційна пробірка – це зниження ризику контамінації. Загальний час проведення аналізу (близько 1 год 15 хв).

Набір для одночасного виявлення 3 генів-мішеней вірусу SARS-CoV-2 та ендогенного внутрішнього контролю:

  • Е-ген  (FAM)
  • N-ген  (HEX)
  • RdRp  (ROX)
  • ендогенний внутрішній контроль  РНКаза Р  (Cy5)

Дизайн олігонуклеотидів та TagMan-зондів на висококонсервативні ділянки генів SARS-CoV-2 дозволяє виявляти всі відомі зараз штами коронавірусу, включаючи VUI-202012/01.

Набір “SARS-CoV-2 три гени” можна використовувати на більшості термоциклерів з детекцією в режимі реального часу, наприклад:

  • Bio-Rad CFX 96, IQ5
  • Applied Biosystems 7500 та інші

Набір “SARS-CoV-2 три гени” розраховано для постановки 96 реакцій об’ємом 25 мкл.

Склад набору:

  • Позитивний контроль (1 мікропробірка)
  • Негативний контроль (1 мікропробірка)
  • Мастер мікс RT (1 мікропробірка)
  • Оліго мікс (1 мікропробірка)
  • Пластмасова ПЛР плашка для різних типів термоциклерів (високого чи низького профілю)*
  • Плівка для закривання лунок

*Комплектація пластику узгоджується з виробником окремо. Колір пластику може відрізнятися від представленого на фото.

 

Актуальна версія інструкції завжди знаходиться в коробці з реагентом

Всі реагенти набору необхідно зберігати за температури мінус 18°С –  мінус 24°С. Пластик, який входить до складу набору рекомендується зберігати за кімнатної температури. У разі зберігання в морозильній камері необхідно вийняти ПЛР-плашки та плівки за годину перед проведенням ПЛР-реакції.

Порогова лінія (threshold line)

Для аналізу даних, отриманих після проведення ПЛР, необхідно автоматично чи в ручному режимі виставити порогову лінію (threshold line) окремо для кожного каналу зчитування флюоресценції.

Виставлення порогової лінії в ручному режимі може бути необхідним у разі виникнення експериментальних помилок, як то помилка піпетування, погане виділення нуклеїнової кислоти зі зразка чи контамінація. В таких випадках програмне забезпечення ампліфікатора може неправильно визначати базову флюоресценцію (base line), порогову лінію (threshold line) та відповідно призведе до отримання хибних значень порогового циклу (Ct).

Базова флюоресценція (“шум”) відповідає флюоресценції на початкових циклах ампліфікації, як правило між циклами 2-15.

Існує два варіанти презентації даних ПЛР: лінійний та логарифмічний.

Правильно виставлена порогова лінія має перетинати початок експоненційної фази зростання флюоресценції у лінійному графіку презентації даних (рис.1).

Рис.1 Виставлення порогової лінії та визначення Ct

Виставляти порогову лінію можна також у логарифмічному графіку презентації даних. Тоді правильно виставлена порогова лінія має перетинати середину експоненційної фази зростання флюоресценції.

Негативний контроль позитивний по SARS-CoV-2

В разі наявності сигналу в негативному контролі на одному з каналів FAM, HEX або ROX, результати ПЛР вважаються недійсними та потребують нової постановки ПЛР (рис.2).

Рис.2 Присутність сигналу на одному з каналів FAM, HEX або ROX в негативному контролі

Ампліфікація внутрішнього контролю

Коли крива ампліфікації має Ct>38 та зразок є негативним в інших каналах, результати вважаються сумнівними та потребують перевиділення зразка та нової постановки ПЛР (рис.3).

Рис.3 Ампліфікація внутрішнього контролю

Масштабування різних флюорофорів

Для одночасного виявлення різних цільових генів в діагностичному наборі використовують різні флюорофори (наприклад, Cy5, FAM, HEX, ROX). Детекція флюоресценції проходить для кожного з флюорофорів на окремому каналі. Відповідно, аналіз результатів необхідно проводити за кожним флюорофором окремо! Інакше, можливі проблеми із масштабуванням графіків різних флюорофорів (рис.4 A) та неправильне виставлення порогової лінії.

Рис.4 A Ампліфікація різних генів-мішеней на каналах FAM, HEX, ROX, Cy5 одночасно

Кожен з флюорофорів має свої значення флюоресценції і, при відображенні одночасно, криві ампліфікації з більш високою інтенсивністю флюоресценції матимуть різний кут нахилу та виглядатимуть “краще” порівняно з іншими, які мають нижчі рівні. Втім, при аналізі за кожним окремим флюорофором, графіки будуть достовірними (рис.4 B, рис.4 C).

Рис.4 B Ампліфікація на каналі Cy5   

Рис.4 С Ампліфікація на каналі ROX

 

Можливі проблеми та методи їх усунення

Проблема

Опис

Можлива причина

Рекомендації з усунення

Немає сигналу у всіх каналах

Немає сигналу флюоресценції в жодному зі зчитуваних каналів.

1. Неправильне виділення зразка.

2. Неправильно змішана реакційна суміш.

3. Неправильні умови  зберігання реагентів.

4. Проблема з ампліфікатором чи окремими лунками (характерно для ампліфікаторів з плашечним форматом термоблоку).

  • Перевиділіть зразок та зробіть нову постановку ПЛР.
  • Ретельно дотримуйтеся інструкцій з виділення зразка та постановки ПЛР.
  • Перевірте умови зберігання набору відповідно до вимог виробника.
  • Зробіть постановку ПЛР з новим набором реагентів.
  • Поставте пробірки з розкапаною сумішшю для ПЛР в інші лунки (для ампліфікаторів з плашечним форматом термоблоку).

 

Внутрішній контроль не дає сигналу

Немає сигналу флюоресценції Внутрішнього контролю на каналі Cy5.

 В лунці присутня висока концентрація інгібітора ПЛР, наприклад етанол, слина, кров, та інші.

  • Перевиділіть зразок та зробіть нову постановку ПЛР.
  • Ретельно дотримуйтеся інструкціям з виділення зразка та постановки ПЛР.

 

Позитивний контроль не дає сигналу

Немає сигналу флюоресценції у каналах FAM, HEX, ROX, Cy5 або значення Ct>37.

1. Неправильне зберігання набору.

2. Помилка оператора під час постановки ПЛР.

  • Перевірте умови зберігання набору відповідно до вимог виробника.
  • Перевиділіть зразок та зробіть нову постановку ПЛР. Перевірте чи правильно додається Внутрішній контроль до зразка відповідно інструкції набору.
  • Ретельно дотримуйтеся інструкціям з виділення зразка та постановки ПЛР.

 

Негативний контроль дає сигнал

В негативному контролі є крива ампліфікації на одному з каналів  (FAM, HEX, ROX).

Сигнал може вказувати на контамінацію реагентів набору позитивним контролем чи клінічними зразками.

  • Протирайте всі робочі поверхні та прилади розчином гіпохлориту натрію до та після роботи для знезаражень поверхонь від забруднення нуклеїновими кислотами (наприклад, ампліконами).
  • Перевиділіть зразок та зробіть нову постановку ПЛР.
  • Використовуйте тільки наконечники з фільтрами та одноразові рукавички.
  • Перевірте всі реагенти на наявність можливого забруднення ампліконами.