Реал-тайм ПЛР для виявлення РНК вірусу SARS-CoV-2, та ендогенного внутрішнього контролю (РНКаза P)
Виявлення коронавірусу SARS-CoV-2 методом подвійної детекції - 96 реакцій
Код продукту: PD10
Дізнатись ціну

ПЛР набір для виявлення коронавірусу SARS-CoV-2 працює за методом ПЛР зі зворотною транскрипцією в режимі реального часу. Детекція вірусу за двома генами-мішенями  підвищує чутливість та надійність тестування. Вірус SARS-CoV-2 визначається за генами: ORF1ab та N-gene, які детектуються на каналі FAM. Це дає можливість просто і швидко виявити наявність або відсутність збудника хвороби COVID-19.

Для контролю етапів забору матеріалу та перебігу реакції ПЛР в наборі застосовується ендогенний внутрішній контроль – РНКаза Р,  яка детектується на каналі Cy5. Він забезпечує ефективний моніторинг проведення тестування,  що є першочерговим для отримання достовірного результату аналізу.

Тест має 100% специфічність, тобто не дає жодної кросс-детекції з іншими організмами.

Кожен набір комплектується розхідним матеріалом для ПЛР реакції — 96-и луночними планшетами та плівками для них. Для максимальної сумісності з ПЛР приборами фірма пропонує два варіанти набору: з високопрофільним пластиком (наприклад, для Bio-Rad IQ5, Applied Biosystems 7500) та низькопрофільним пластиком (наприклад, для Bio-Rad CFX).

Компоненти від європейських виробників та багаторічний досвід в розробці ПЛР тестів – запорука успіху для вашої лабораторії!

ПЛР набори від PolyDiagnostics – це зворотня транскрипція та ПЛР в  одній пробірці. Використання системи реакцій зворотної транскрипціїї  з подальшою ампліфікацією забезпечує  швидкість аналізу (близько 1 год 15 хв) та безпеку оператора.

Набір для одночасного виявлення 2 генів-мішеней SARS-CoV-2 та ендогенного внутрішнього контролю:

  • N-ген  (FAM)
  • ORF1ab  (FAM)
  • ендогенний внутрішній контроль  РНКаза Р  (Cy5)

Дизайн олігонуклеотидів та TagMan-зондів на висококонсервативні ділянки генів SARS-CoV-2 дозволяє виявляти всі відомі зараз штами коронавірусу, включаючи VUI-202012/01.

Завдяки  використанню в наборі двох найбільш поширених флюорофорів FAM та Cy5, він сумісний з більшістю термоциклерів із детекцією в режимі реального часу, наприклад:

  • Bio-Rad CFX 96, IQ5
  • Applied Biosystems 7500 та інші

Набір “SARS-CoV-2 з ендогенним контролем” розраховано для постановки 96 реакцій об’ємом 25 мкл.

Склад набору:

  • Позитивний контроль (1 мікропробірка)
  • Негативний контроль (1 мікропробірка)
  • Мастер мікс RT (1 мікропробірка)
  • Оліго мікс (1 мікропробірка)
  • Пластмасова ПЛР плашка для різних типів термоциклерів (високого чи низького профілю)*
  • Плівка для закривання лунок

 

*Комплектація пластику узгоджується з виробником окремо. Колір пластику може відрізнятися від представленого на фото.

 

Актуальна версія інструкції завжди знаходиться в коробці з реагентом!

Всі реагенти набору необхідно зберігати за температури мінус 18°С –  мінус 24°С. Пластик, який входить до складу набору рекомендується зберігати за кімнатної температури. У разі зберігання в морозильній камері необхідно вийняти ПЛР-плашки та плівки за годину перед проведенням ПЛР-реакції.

Порогова лінія (threshold line)

Для аналізу даних, отриманих після проведення ПЛР, необхідно автоматично чи в ручному режимі виставити порогову лінію (threshold line) окремо для кожного каналу зчитування флюоресценції.

Виставлення порогової лінії в ручному режимі може бути необхідним у разі виникнення експериментальних помилок, як то помилка піпетування, погане виділення нуклеїнової кислоти зі зразка чи контамінація. В таких випадках програмне забезпечення ампліфікатора може неправильно визначати базову флюоресценцію (base line), порогову лінію (threshold line) та відповідно призведе до отримання хибних значень порогового циклу (Ct).

Базова флюоресценція (“шум”) відповідає флюоресценції на початкових циклах ампліфікації, як правило між циклами 2-15.

Існує два варіанти презентації даних ПЛР: лінійний та логарифмічний.

Правильно виставлена порогова лінія має перетинати початок експоненційної фази зростання флюоресценції у лінійному графіку презентації даних (рис.1).

Рис.1 Виставлення порогової лінії та визначення Ct

Виставляти порогову лінію можна також у логарифмічному графіку презентації даних. Тоді правильно виставлена порогова лінія має перетинати середину експоненційної фази зростання флюоресценції.

Негативний контроль позитивний по SARS-CoV-2

В разі наявності сигналу в негативному контролі, результати ПЛР вважаються недійсними та потребують нової постановки ПЛР (рис.2).

Рис.2 Присутність сигналу на каналі FAM в негативному контролі

Ампліфікація внутрішнього контролю

Коли крива ампліфікації має Ct>38 та зразок є негативним в іншому каналі, результати вважаються сумнівними та потребують перевиділення зразка та нової постановки ПЛР (рис.3).

Рис.3 Ампліфікація внутрішнього контролю

Масштабування різних флюорофорів

Для одночасного виявлення різних цільових генів в діагностичному наборі використовують різні флюорофори (наприклад, Cy5, FAM, HEX, ROX). Детекція флюоресценції проходить для кожного з флюорофорів на окремому каналі. Відповідно, аналіз результатів необхідно проводити за кожним флюорофором окремо! Інакше, можливі проблеми із масштабуванням графіківрізних флюорофорів (рис.4 A) та неправильне виставлення порогової лінії.

Кожен з флюорофорів має свої значення флюоресценції і, при відображенні одночасно, криві ампліфікації з більш високою інтенсивністю флюоресценції матимуть різний кут нахилу та виглядатимуть “краще” порівняно з іншими, які мають нижчі рівні. Втім, при аналізі за кожним окремим флюорофором, графіки будуть достовірними (рис.4 B, рис.4 C).

Рис.4 B Ампліфікація на каналі Cy5

Рис.4 С Ампліфікація на каналі ROX

 

 

Можливі проблеми та методи їх усунення

Проблема

Опис

Можлива причина

Рекомендації з усунення

Немає сигналу у всіх каналах

Немає сигналу флюоресценції в жодному зі зчитуваних каналів.

1. Неправильне виділення зразка.

2. Неправильно змішана реакційна суміш.

3. Неправильний режим зберігання реагентів.

4. Проблема з ампліфікатором чи окремими лунками (характерно для ампліфікаторів з плашечним форматом термоблоку).

  • Перевиділіть зразок та зробіть нову постановку ПЛР.
  • Ретельно дотримуйтеся інструкцій з виділення зразка та постановки ПЛР.
  • Перевірте умови зберігання набору відповідно до вимог виробника.
  • Зробіть постановку ПЛР з новим набором реагентів.
  • Поставте пробірки з розкапаною сумішшю для ПЛР в інші лунки (для ампліфікаторів з плашечним форматом термоблоку).

 

Внутрішній контроль не дає сигналу

Немає сигналу флюоресценції Внутрішнього контролю на каналі HEX.

 В лунці присутня висока концентрація інгібітора ПЛР, наприклад, етанол, слина, кров, та інші.

  • Перевиділіть зразок та зробіть нову постановку ПЛР.
  • Ретельно дотримуйтеся інструкціям з виділення зразка та постановки ПЛР.

 

Позитивний контроль не дає сигналу

Немає сигналу флюоресценції у каналі FAM або значення Ct>37.

1. Неправильне зберігання набору.

2. Помилка оператора під час постановки ПЛР.

  • Перевірте умови зберігання набору відповідно до вимог виробника.
  • Перевиділіть зразок та зробіть нову постановку ПЛР.
  • Ретельно дотримуйтеся інструкціям з виділення зразка та постановки ПЛР.

 

Негативний контроль дає сигнал

В негативному контролі є крива ампліфікації на каналі FAM.

 Сигнал може вказувати на контамінацію реагентів набору позитивним контролем чи клінічними зразками.

  • Протирайте всі робочі поверхні та прилади розчином гіпохлориту натрію до та після роботи для знезаражень поверхонь від забруднення нуклеїновими кислотами (наприклад, ампліконами).
  • Перевиділіть зразок та зробіть нову постановку ПЛР.
  • Використовуйте тільки наконечники з фільтрами та одноразові рукавички.
  • Перевірте всі реагенти на наявність можливого забруднення ампліконами.