Реал-тайм ПЛР для виявлення РНК вірусу SARS-CoV-2 з екзогенним внутрішнім контролем
Виявлення коронавірусу SARS-CoV-2 методом подвійної детекції - 96 реакцій
Код продукту: PD1
Дізнатись ціну

ПЛР тест на виявлення коронавірусу SARS-CoV-2 працює за методом ПЛР зі зворотною транскрипцією в режимі реального часу. Детекція вірусу за двома генами-мішенями  підвищує чутливість та надійність тестування. Вірус SARS-CoV-2 визначається за двома генами: ORF1ab та N-gene, які детектуються на каналі FAM. Це дає можливість просто і швидко виявити наявність або відсутність збудника хвороби COVID-19.

100% специфічність — тест не має жодної кросс-детекції з іншими організмами.

У кожній реакції – РНК-вмісний внутрішній контроль – вірусоподібна частинка (на основі бактеріофага MS2), яка імітує віруси, захищає РНК від деградації та дозволяє проводити ефективний контроль виділення нуклеїнової кислоти та перебігу реакції. Це є важливим для тих, хто має високі стандарти якості та хоче забезпечити моніторинг кожного етапу аналізу.

Кожен набір комплектується розхідним матеріалом для ПЛР реакції — 96-и луночними планшетами та плівками для них. Для максимальної сумісності з ПЛР приборами фірма пропонує два варіанти набору: з високопрофільним пластиком (наприклад, для Bio-Rad IQ5, Applied Biosystems 7500) та низькопрофільним пластиком (наприклад, для Bio-Rad CFX).

Багаторічний досвід в розробці ПЛР тестів та найкращі компоненти дозволяють нашим клієнтам із впевненістю покладатись на результати, отримані нашими тестами — висока чутливість та специфічність!

ПЛР набори від PolyDiagnostics – це зворотня транскрипція та ПЛР в  одній пробірці. Використання системи реакцій зворотної транскрипціїї  з подальшою ампліфікацією знижує ризик контамінації. Загальний час проведення аналізу (близько 1 год 15 хв).

Набір для одночасного виявлення 2 генів-мішеней SARS-CoV-2 та екзогенного внутрішнього контролю:

  • N-ген  (FAM)
  • ORF1ab  (FAM)
  • РНК-вмісний екзогенний внутрішній контроль (HEX)

Дизайн олігонуклеотидів та TagMan-зондів на висококонсервативні ділянки генів SARS-CoV-2 дозволяє виявляти всі відомі зараз штами коронавірусу, включаючи VUI-202012/01.

Завдяки використанню в наборі двох найбільш поширених флюорофорів FAM та HEX, він сумісний з більшістю термоциклерів із детекцією в режимі реального часу, наприклад:

  • Bio-Rad CFX 96, IQ5, MiniOpticon
  • Applied Biosystems 7500 та інші

Набір “SARS-CoV-2 з екзогенним контролем” розраховано для постановки 96 реакцій об’ємом 25 мкл.

Склад набору:

  • Позитивний контроль (1 мікропробірка)
  • Негативний контроль (1 мікропробірка)
  • Мастер мікс RT (1 мікропробірка)
  • Оліго мікс (1 мікропробірка)
  • Екзогенний внутрішній контроль (1 мікропробірка)
  • Пластмасова ПЛР плашка для різних типів термоциклерів (високого чи низького профілю)*
  • Плівка для закривання лунок

 

*Комплектація пластику узгоджується з виробником окремо. Колір пластику може відрізнятися від представленого на фото.

 

 

Актуальна версія інструкції завжди знаходиться в коробці з реагентом!

Всі реагенти набору необхідно зберігати за температури мінус 18°С –  мінус 24°С. Пластик, який входить до складу набору рекомендується зберігати за кімнатної температури. У разі зберігання в морозильній камері необхідно вийняти ПЛР-плашки та плівки за годину перед проведенням ПЛР-реакції.

Порогова лінія (threshold line)

Для аналізу даних, отриманих після проведення ПЛР, необхідно автоматично чи в ручному режимі виставити порогову лінію (threshold line) окремо для кожного каналу зчитування флюоресценції.

Виставлення порогової лінії в ручному режимі може бути необхідним у разі виникнення експериментальних помилок, як то помилка піпетування, погане виділення нуклеїнової кислоти зі зразка чи контамінація. В таких випадках програмне забезпечення ампліфікатора може неправильно визначати базову флюоресценцію (base line), порогову лінію (threshold line) та відповідно призведе до отримання хибних значень порогового циклу (Ct).

Базова флюоресценція (“шум”) відповідає флюоресценції на початкових циклах ампліфікації, як правило між циклами 2-15.

Існує два варіанти презентації даних ПЛР: лінійний та логарифмічний.

Правильно виставлена порогова лінія має перетинати початок експоненційної фази зростання флюоресценції у лінійному графіку презентації даних (рис.1).

Рис.1 Виставлення порогової лінії та визначення Ct

Виставляти порогову лінію можна також у логарифмічному графіку презентації даних. Тоді правильно виставлена порогова лінія має перетинати середину експоненційної фази зростання флюоресценції.

Негативний контроль позитивний по SARS-CoV-2

В разі наявності сигналу в негативному контролі, результати ПЛР вважаються недійсними та потребують нової постановки ПЛР (рис.2).

Рис.2 Присутність сигналу на каналі FAM в негативному контролі

Ампліфікація внутрішнього контролю

Коли крива ампліфікації має Ct>38 та зразок є негативним в іншому каналі, результати вважаються сумнівними та потребують перевиділення зразка та нової постановки ПЛР (рис.3).

Рис.3 Ампліфікація внутрішнього контролю

Масштабування різних флюорофорів

Для одночасного виявлення різних цільових генів в діагностичному наборі використовують різні флюорофори (наприклад, Cy5, FAM, HEX, ROX). Детекція флюоресценції проходить для кожного з флюорофорів на окремому каналі. Відповідно, аналіз результатів необхідно проводити за кожним флюорофором окремо! Інакше, можливі проблеми із масштабуванням графіків різних флюорофорів (рис.4 A) та неправильне виставлення порогової лінії.

Рис.4 А Ампліфікація різних генів-мішеней на каналах FAM, HEX, ROX, Cy5

Кожен з флюорофорів має свої значення флюоресценції і, при відображенні одночасно, криві ампліфікації з більш високою інтенсивністю флюоресценції матимуть різний кут нахилу та виглядатимуть “краще” порівняно з іншими, які мають нижчі рівні. Втім, при аналізі за кожним окремим флюорофором, графіки будуть достовірними (рис.4 B, рис.4 C).

Рис.4 B Ампліфікація на каналі Cy5

Рис.4 С Ампліфікація на каналі ROX

 

Можливі проблеми та методи їх усунення

Проблема

Опис

Можлива причина

Рекомендації з усунення

Немає сигналу у всіх каналах

Немає сигналу флюоресценції в жодному зі зчитуваних каналів.

1. Неправильне виділення зразка.

2. Неправильно змішана реакційна суміш.

3. Непрпавильні умови зберігання реагентів.

4. Проблема з ампліфікатором чи окремими лунками (характерно для ампліфікаторів з плашечним форматом термоблоку).

  • Перевиділіть зразок та зробіть нову постановку ПЛР. Перевірте чи правильно додається Внутрішній контроль до зразка відповідно інструкції набору.
  • Ретельно дотримуйтеся інструкцій з виділення зразка та постановки ПЛР.
  • Перевірте умови зберігання набору відповідно до вимог виробника.
  • Зробіть постановку ПЛР з новим набором реагентів.
  • Поставте пробірки з розкапаною сумішшю для ПЛР в інші лунки (для ампліфікаторів з плашечним форматом термоблоку).

 

Внутрішній контроль не дає сигналу

Немає сигналу флюоресценції Внутрішнього контролю на каналі HEX.

1. Внутрішній контроль не було додано до реакції, чи додано в неправильній кількості.

2. В лунці присутня висока концентрація інгібітора ПЛР, наприклад етанол, слина, кров, та інші.

  • Перевиділіть зразок та зробіть нову постановку ПЛР. Перевірте чи правильно додається Внутрішній контроль до зразка відповідно до інструкції набору.
  • Ретельно дотримуйтеся інструкціям з виділення зразка та постановки ПЛР.

 

Позитивний контроль не дає сигналу

Немає сигналу флюоресценції у каналі FAM або значення Ct>37.

1. Неправильне зберігання набору.

2. Помилка оператора під час постановки ПЛР.

  • Перевірте умови зберігання набору відповідно до вимог виробника.
  • Перевиділіть зразок та зробіть нову постановку ПЛР. Перевірте чи правильно додається Внутрішній контроль до зразка відповідно інструкції набору.
  • Ретельно дотримуйтеся інструкціям з виділення зразка та постановки ПЛР.

 

Негативний контроль дає сигнал

В негативному контролі є крива ампліфікації на каналі FAM.

 Сигнал може вказувати на контамінацію реагентів набору позитивним контролем чи клінічними зразками.

  • Протирайте всі робочі поверхні та прилади розчином гіпохлориту натрію до та після роботи для знезаражень поверхонь від забруднення нуклеїновими кислотами (наприклад, ампліконами).
  • Перевиділіть зразок та зробіть нову постановку ПЛР.
  • Використовуйте тільки наконечники з фільтрами та одноразові рукавички.
  • Перевірте всі реагенти на наявність можливого забруднення ампліконами.