PD9D “Poly Diagnostics® InfB (грип Б) реал-тайм ПЛР – Dry” – розфасовані сухі реагенти
Набір сухих розфасованих реагентів для диференціального виявлення РНК вірусу грипу Б
Код продукту: PD9D
Дізнатись ціну

ПЛР набір для виявлення РНК грипу Б є високоспецифічним та чутливим тестом для виявлення грипу Б в біологічному матеріалі людини методом полімеразної ланцюгової реакції зі зворотньою транскрипцією в режимі реального часу.

Постановка реакції максимально зручна – достатньо просто додати клінічний зразок! Час постановки реакції 1 год 6 хв. Термін зберігання набору 24 місяці з дня виробництва! Набір зберігається при кімнатній температурі.

Для контролю етапів забору матеріалу та перебігу реакції ПЛР в наборі застосовується ендогенний внутрішній контроль – РНКаза Рщо забезпечує ефективний моніторинг проведення тестування,  що є першочерговим для отримання достовірного результату аналізу.

Тест детектує всі відомі штами вірусів грипу Б.

ПЛР набори від PolyDiagnostics – це зворотня транскрипція та ПЛР в  одній пробірці. Використання системи реакцій зворотної транскрипціїї  з подальшою ампліфікацією забезпечує  швидкість аналізу (близько 1 год 6 хв) та безпеку оператора.

Набір “Poly Diagnostics® InfB (грип Б) реал-тайм ПЛР – Dry” розроблено для одночасного виявлення РНК грипу Б, а також ендогенного внутрішнього контролю:

  • Грип Б (HEX)
  • ендогенний внутрішній контроль  РНКаза Р  (Cy5)

Набір можна використовувати на більшості термоциклерів з детекцією в режимі реального часу, наприклад:

  • Bio-Rad CFX 96, IQ5
  • Applied Biosystems 7500 та інші

Набір розраховано для постановки 96 реакцій об’ємом 20 мкл.

Склад набору:

  • Суха реакційна суміш розфасована в стріпи по 8-лунок

Актуальна версія інструкції завжди знаходиться в коробці з реагентом!

Порогова лінія (threshold line)

Для аналізу даних, отриманих після проведення ПЛР, необхідно автоматично чи в ручному режимі виставити порогову лінію (threshold line) окремо для кожного каналу зчитування флюоресценції.

Виставлення порогової лінії в ручному режимі може бути необхідним у разі виникнення експериментальних помилок, як то помилка піпетування, погане виділення нуклеїнової кислоти зі зразка чи контамінація. В таких випадках програмне забезпечення ампліфікатора може неправильно визначати базову флюоресценцію (base line), порогову лінію (threshold line) та відповідно призведе до отримання хибних значень порогового циклу (Ct).

Базова флюоресценція (“шум”) відповідає флюоресценції на початкових циклах ампліфікації, як правило між циклами 2-15.

Існує два варіанти презентації даних ПЛР: лінійний та логарифмічний.

Правильно виставлена порогова лінія має перетинати початок експоненційної фази зростання флюоресценції у лінійному графіку презентації даних (рис.1).

Рис.1 Виставлення порогової лінії та визначення Ct

Виставляти порогову лінію можна також у логарифмічному графіку презентації даних. Тоді правильно виставлена порогова лінія має перетинати середину експоненційної фази зростання флюоресценції.

Негативний контроль позитивний на FAM, HEX, ROX

В разі наявності сигналу на каналі FAM, HEX, ROX в негативному контролі, результати ПЛР вважаються недійсними та потребують нової постановки ПЛР (рис.2).

Рис.2 Присутність сигналу на каналі FAM в негативному контролі

Ампліфікація внутрішнього контролю (Cy5)

Коли крива ампліфікації має Ct>35 та зразок є негативним на каналі Cy5 (внутрішній контроль) результати вважаються сумнівними та потребують перевиділення зразка та нової постановки ПЛР (рис.3).

Рис.3 Ампліфікація внутрішнього контролю

Масштабування різних флюорофорів

Для одночасного виявлення різних цільових мішеней в діагностичному наборі використовують різні флюорофори (наприклад, Cy5, FAM, HEX, ROX). Детекція флюоресценції проходить для кожного з флюорофорів на окремому каналі. Відповідно, аналіз результатів необхідно проводити за кожним флюорофором окремо! Інакше, можливі проблеми із масштабуванням графіківрізних флюорофорів (рис.4 A) та неправильне виставлення порогової лінії.

Кожен з флюорофорів має свої значення флюоресценції і, при відображенні одночасно, криві ампліфікації з більш високою інтенсивністю флюоресценції матимуть різний кут нахилу та виглядатимуть “краще” порівняно з іншими, які мають нижчі рівні. Втім, при аналізі береться тільки значення Ct (рис.4 B, рис.4 C).

Рис.4 B Ампліфікація на каналі Cy5

Рис.4 С Ампліфікація на каналі ROX

 

 

Можливі проблеми та методи їх усунення

Проблема

Опис

Можлива причина

Рекомендації з усунення

Немає сигналу у всіх каналах

Немає сигналу флюоресценції в жодному зі зчитуваних каналів.

1. Неправильне виділення зразка.

2. Неправильно змішана реакційна суміш.

3. Неправильний режим зберігання реагентів.

4. Проблема з ампліфікатором чи окремими лунками (характерно для ампліфікаторів з плашечним форматом термоблоку).

  • Перевиділіть зразок та зробіть нову постановку ПЛР.
  • Ретельно дотримуйтеся інструкцій з виділення зразка та постановки ПЛР.
  • Перевірте умови зберігання набору відповідно до вимог виробника.
  • Зробіть постановку ПЛР з новим набором реагентів.
  • Поставте пробірки з розкапаною сумішшю для ПЛР в інші лунки (для ампліфікаторів з плашечним форматом термоблоку).

 

Внутрішній контроль не дає сигналу

Немає сигналу флюоресценції Внутрішнього контролю.

В лунці присутня висока концентрація інгібітора ПЛР, наприклад, етанол, слина, кров, та інші.

  • Перевиділіть зразок та зробіть нову постановку ПЛР.
  • Ретельно дотримуйтеся інструкціям з виділення зразка та постановки ПЛР.

 

Позитивний контроль не дає сигналу

Немає сигналу флюоресценції або значення Ct>37.

1. Неправильне зберігання набору.

2. Помилка оператора під час постановки ПЛР.

  • Перевірте умови зберігання набору відповідно до вимог виробника.
  • Перевиділіть зразок та зробіть нову постановку ПЛР.
  • Ретельно дотримуйтеся інструкціям з виділення зразка та постановки ПЛР.

 

Негативний контроль дає сигнал

В негативному контролі є крива ампліфікації.

Сигнал може вказувати на контамінацію позитивним контролем чи клінічними зразками.

  • Протирайте всі робочі поверхні та прилади розчином гіпохлориту натрію до та після роботи для знезаражень поверхонь від забруднення нуклеїновими кислотами (наприклад, ампліконами).
  • Перевиділіть зразок та зробіть нову постановку ПЛР.
  • Використовуйте тільки наконечники з фільтрами та одноразові рукавички.
  • Перевірте всі реагенти на наявність можливого забруднення ампліконами.